Содержание
В настоящее время разработка энергосберегающих и ресурсосберегающих технологий для целей химической отрасли является весьма актуальной.
Частным случаем таких технологий является использование микроорганизмов — продуцентов коммерчески значимых продуктов для трансформации различных отходов в следующих промышленностях:
- Пищевой.
- Сельское хозяйство.
- Деревообрабатывающей.
Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов в различных процессах весьма привлекательно, по следующим причинам:
- Возможность значительно увеличить длительность использовать одной и той же биомассы продуцента.
- Упростить стадии отделения биомассы от культуральной жидкости, согласно работе [1].
- Получить повышению устойчивости клеток к негативным факторам.
Методология предлагаемого решения
Фумаровая кислота нашла широкое применение в различных областях:
- В пищевой промышленности в качестве регулятора кислотности.
- В медицине при лечении псориаза, для получения янтарной и яблочных кислот.
- В химической промышленности для получения различных полиэфиров, алкидных смол, пластификаторов.
В настоящее время промышленный синтез фумаровой кислоты происходит с участием малеиновой кислоты и катализаторов в водных растворах при низких значениях pH.
Альтернативой такому методу получения может служить биотехнологический способ, осуществляемый путем трансформации углеводсодержащих субстратов (моносахаров) в фумаровую кислоту под действием мицелиальных грибов рода Rhizopus.
Использование в качестве субстратов целлюлозосодержащих отходов деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства должно обеспечить улучшение экономической и экологической составляющих процесса получения конечного продукта.
Данная работа была направлена на реализацию процесса получения фумаровой кислоты из различных ферментативных гидролизатов целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) под действием биокатализатора, в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae.
В работе в качестве продуцента фумаровой кислоты использовался мицелиальный гриб R:
- oryzae F — 1032(ВКПМ).
Биокатализатор в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Roryzae был получен согласно ранее разработанной методике из патента [2].
Ферментативные гидролизаты ЦСС (100 г с.в./л) получены путем обработки измельченной пшеничной соломы и осиновых опилок коммерческими препаратами целлюлаз (Sigma, США) в расчете 6 мг/г субстрата в течение 48 ч при 55°С.
Концентрация глюкозы в них определялась с использованием стандартного набора реагентов (Импакт, Россия).
Концентрацию фумаровой кислоты, накапливающейся в среде, определяли с использованием набора стандартных реагентов (Abcam, Англия).
Концентрация внутриклеточного АТФ в иммобилизованных клетках R oryzae определялась биолюминесцентным люциферин-люцеферазным методом, описанным ранее в статье [3].
Результаты проведенных исследований
Для исследования возможности трансформации ферментативных гидролизатов ЦСС в качестве субстрата использовалась пшеничная солома и опилки осины, представляющие собой отходы сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности.
Концентрация глюкозы в них составляла, соответственно:
- Для осиновых опилок — 39,7±0,1 г/л.
- Для пшеничной соломы составила 34,8±0,1 г/л.
Культивирование иммобилизованных клеток R oryzae осуществлялось при следующих условиях:
- Температура 32 °С.
- Продолжительность цикла культивирования иммобилизованных клеток 48 ч.
- Использовалась концентрация биокатализатора в питательной среде равной 65 г/л.
После 48 часов биокатализатор отделяется, от культуральной жидкости и в реактор с иммобилизованными клетками R oryzae подавалась свежая питательная среда (ферментативные гидролизаты) аналогичного состава.
Процесс накопления фумаровой кислоты в различных средах представлен на рисунке 1:
где
- Белая гистограммы — остовые опилки.
- Черные гистограммы — пшеничная солома.
- Общая продолжительность культивирования иммобилизованных клеток R oryzae составила 480 ч.
- За время использования биокатализатора было отмечено снижение его продуктивности на 11,4±0,2%.
По окончании каждого цикла контролировалась концентрация внутриклеточного АТФ в иммобилизованных клетках, как одного из показателей, свидетельствующих об их физиологическом состоянии.
Было установлено, что уровень данного параметра колебался в пределах одного порядка, что подтверждало уровень метаболической активности иммобилизованных клеток мицелиального гриба R oryzae на протяжении всего процесса использования для получения фумаровой кислоты из ферментативных гидролизатов ЦСС.
Более низкие концентрации накапливающегося конечного продукта были отмечены при использовании в качестве субстрата осиновых опилок согласно рисунку 1.
Основные результате проведенных экспериментов сведем в сводную таблицу 1:
Как видно из таблицы, полученные в данной работе результаты по выходу фумаровой кислоты соответствуют лучшим мировым аналогам.
Однако использование продуцента в иммобилизованном виде для трансформации гидролизатов ЦСС позволяет более, чем в 2 раза (в зависимости от источника сырья) увеличить срок использования клеток мицелиального гриба R oryzae, взятых не в свободном, а в иммобилизованном виде.
Таким образом, была продемонстрирована возможность использования иммобилизованных клеток мицелиального гриба R oryzae для реализации ресурсосберегающего процесса получения фумаровой кислоты из ферментативных гидролизатов ЦСС.
Список литературы
- Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола. / Ефременко Е.Н. [и другие] // Катализ в промышленности, 2010 год, том 5, страницы 70-76.
- Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора / Ефременко Е.Н. [и другие] // Патент РФ на изобретение № 2253677, 2002 год.
- Rhizopus oryzae fungus cells producing L(+)-lactic acid: kinetic and metabolic parameters of free and PVA-cryogel-entrapped mycelium./Efremenko E.N. [et al] // Appl Microb Biotech, 2006. -V.72. — P.480-485.
- Co-production of fumaricacid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material — dairy manure — using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344 / Liao W. [et al] //Bioresour Technol, 2008. — V. 99. — P. 5859-5866.
- Fermentative production of fumaric acid from Eucalyptus globulus wood hydrolyzates / Rodriguez- Lopez. [etal] // J Chem Technol Biotech, 2012. -V. 87. — P. 1036-1040.
- Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse / Carta F.S. [et al] / / Bioresour Technol, 1999. — V. 68. — P. 23-28.
- Two-stage utilization of com straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production. / Xu Q. [et al] // Bioresour Technol, 2010. — V. 101. — P. 6262-6266.
- Трансформация возобновляемых источников энергии в виде целлюлозосодержащих отходов в биоэтанол.
Источник: Ресурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья / О.В. Сенько, Н.А. Степанов, О.В. Маслова, И.В. Лягин, Е.Н. Ефременко // Вестник КузГТУ, 2013 год, №1, страницы 111-113.
